[FAU-Logo] Sonderforschungsbereich 539

Zusammenfassung

 

.Molekulare Pathomechanismen bei Glaukomen sind größtenteils unbekannt. Bei der Suche nach relevanten Genen haben wir in Vorarbeiten eine Hochregulation von epithelialen Na+-Kanälen (ENaCs) in Retina und Pigmentepithel glaukomatöser Augen mit erhöhtem Innendruck gefunden.
Die Funktion der ENaCs in diesen Geweben ist nahezu unbekannt. Daher soll eine präzise zelluläre und subzelluläre Lokalisation dieser Proteine in der Retina und angrenzenden Epithelschichten die Grundlage für die Formulierung von Hypothesen zu möglichen Funktionen der ENaCs sowohl in der normalen, als auch in der erkrankten Retina, legen.

Epitheliale Na+-Kanäle (ENaCs) - heterotetramere Proteinkomplexe bestehend aus a-, b-, g-
und/oder d-Untereinheiten - sind maßgeblich am Na+-Transport in Geweben beteiligt und damit indirekt
an der Flüssigkeitsregulation. Die wichtige Rolle dieser Kanäle zeigt sich zum einen bei Mutationen der
b- und g-Untereinheit, die eine Form des Bluthochdruckes (Liddle’s Syndrom) verursachen, und zum
anderen an ENaC-defizienten Mäusen, die kurz nach der Geburt sterben.
In Vorarbeiten lokalisierten wir ENaCs in der Retina und dem retinalen Pigmentepithel von Augen mit
erhöhtem Innendruck (DBA/2J Mäuse), jedoch nicht in Augen mit Normaldruck. Tiere des DBA/2J
Stammes dienen als Tiermodell für Sekundärglaukome, da sie ab dem 6. Lebensmonat einen erhöhten
Augeninnendruck mit anschließendem Ganglienzelltod entwickeln. Es scheint damit ein Zusammenhang
zwischen dem erhöhten Augeninnendruck und der Hochregulierung der ENaCs zu bestehen.
Die Kenntnis der Lokalisation der ENaCs in der Retina und den angrenzenden Epithelschichten
ist Voraussetzung für ein besseres Verständnis der Funktion dieser Proteine in der glaukomatösen,
sowie in der gesunden Retina. Wir wollen daher in diesem neu beantragten Teilprojekt im Detail
die zelluläre Expression und die subzelluläre Lokalisation der ENaC-Untereinheiten in der Retina,
dem retinalen Pigmentepithel und dem Ziliarkörper im Vergleich zwischen Augen mit normalem und erhöhtem Druck von DBA/2J Mäusen untersuchen. Zusätzlich wollen wir die ENaC-Expression
mit der Erhöhung des Augeninnendrucks und dem Auftreten von apoptotischen Ganglienzellen
zu unterschiedlichen Alterstufen dieser Tiere vergleichen. Für die Untersuchungen ist es notwendig,
spezifische Immunseren zum Nachweis der ENaC-Untereinheiten zu generieren. Da ENaCs einem
gewebespezifischen alternativen Spleißen unterliegen, soll die Auswahl geeigneter Epitope
zur Antikörperherstellung auf der Grundlage der aus Mäuseretina klonierten ENaC cDNA-Sequenzen
erfolgen. Aus den Ergebnissen unserer Untersuchungen erhoffen wir uns konzeptuell neue Einsichten
zur Funktion der ENaCs im gesunden Auge und im Auge mit erhöhtem Innendruck, wie er bei Glaukomerkrankungen auftritt.


Ausgangssituation des Teilprojektes (Stand der Forschung)

1. Epitheliale Natriumkanäle:

   
 

Epitheliale Na+-Kanäle (ENaCs) gehören zur ENaC/DEG Superfamilie, der auch protonengesteuerte
Kationenkanäle und Proteine der Degenerin Familie angehören (Kellenberger und Schild, 2002).
ENaCs spielen beim Na+-Transport und damit indirekt bei der Flüssigkeitsregulation in Geweben eine
wichtige Rolle. Bisher wurden vier Mitglieder der ENaC-Familie kloniert:a-, b-, g- und d-ENaC; d-ENaC
wurde bislang nur beim Menschen und beim Schimpansen (NCBI accession number: AF038165) gefunden.
Funktionelle ENaCs sind heterotetramere Proteinkomplexe, die sich aus den genannten Untereinheiten
zusammensetzen. Co-Expression von a-, b- und g-ENaC in Xenopus Oocyten resultiert in robusten
Natriumströmen, die durch den Natriumkanalblocker Amilorid hemmbar sind (Canessa et al., 1994). Die Co-Expression von a-ENaC mit b- oder g-ENaC generierte ca. 5-fach kleinere Stromamplituden, und die individuelle Expression von a- und d-ENaC zeigte zwar noch messbare, aber ca. 100-fach kleinere Stromamplituden als eine Co-Expression von a-, b- und g-ENaC (McNicholas und Canessa, 1997). Basierend auf diesen Daten nimmt man an, dass funktionelle ENaCs aus a-, b- und g-Untereinheiten bestehen. Beta- und g-ENaC sind auch für den Transport des heterooligomeren Natriumkanals zur äußeren
Zellmembran wichtig (Konstas und Korbmacher, 2003).
Das Zusammenspiel von ENaCs und der Na+/K+-ATPase in Epithelzellen von z.B. der Niere und der Lunge
gewährleistet die intrazelluläre Homöostase und die Aufrechterhaltung eines konstanten extrazellulären
Flüssigkeitsvolumens (Mano und Driscoll, 1999). Mutationen in der b- und der g-Untereinheit verursachen
z.B. eine Form des Bluthochdruckes (Liddle’s Syndrom; Shimkets et al., 1994; Lifton, 1995), und ENaC-defiziente Mäuse sterben kurz nach der Geburt, weil Lunge und Nieren nicht funktionieren (Hummler et al., 1996; Barker et al., 1998; McDonald et al., 1999).

 
2. Epitheliale Natriumkanäle am Auge:
 

IInnerhalb des Auges sind ENaC-Untereinheiten im Ziliarepithel exprimiert. Die funktionelle Bedeutung
der ENaCs in diesen Zellen ist noch nicht vollständig geklärt, aber Civan et al. (1997 )und Rauz et al. (2003)
diskutierten, dass sie an Flüssigkeitsresorbtionsvorgängen im Ziliarkörper beteiligt sein könnten. ENaCs
wurden auch in nicht-epithelialen Geweben wie der Retina gefunden (Matsuo, 1998), allerdings sind die Daten zur Expression von ENaCs in diesem Gewebe widersprüchlich. Eine Studie von Mirshahi et al. (1999) wies z.B. a-ENaC Immunreaktivität in mehreren neuronalen Zelltypen der Retina nach: In Photorezeptoren, in Amakrin-, Bipolar- und Ganglienzellen und im retinalen Pigmentepithel, nicht aber in den Müller-Gliazellen. Im Unterschied dazu wies eine andere Studie a-ENaC ausschließlich in Müllerzellen nach (Golestaneh et al., 2001), ein Befund, der in einer weiterer Studie bestätigt wurde (Brockway et al., 2002). Auch b-ENaC wurde von dieser Arbeitsgruppe in verschiedenen retinalen Zelltypen detektiert, vor
allem in Amakrin- und Ganglienzellen.
In eigenen Vorarbeiten analysierten wir die Verteilung von a-, b- und g-ENaC in der Mausretina. Während
in der gesunden Retina keine der drei untersuchten ENaCs nachweisbar waren, fanden wir in glaukomatösen Netzhäuten von Augen mit erhöhtem Innendruck deutliche Signale von a-und g-ENaC
Immunreaktivität in verschiedenen, nicht weiter charakterisierten Zelltypen der neuronalen Retina und im retinalen Pigmentepithel (Dyka et al., 2005).
Eine mögliche Funktion von ENaC-Untereinheiten in Nervenzellen wird in einer aktuellen Studie
vorgeschlagen (Drummond et al., 2005). Das durch den Nervenwachstumsfaktor NGF induzierte
Neuritenwachstum in neuronalen PC2 Zellen geht mit einer Expression von b- und g-ENaC, aber nicht von a-ENaC einher. Die Unterdrückung der Expression dieser ENaCUntereinheiten verhindert das NGF-induzierte Auswachsen der Neuriten. Aus ihren Ergebnissen schließen die Autoren, dass die Expression von b- und g-ENaC durch NGF reguliert wird, und dass diese ENaC-Untereinheiten für das Neuritenwachstum benötigt werden. Somit könnten ENaC-Untereinheiten eine Rolle in der neuronalen Differenzierung spielen. Da aber keine neurologischen Defekte in den oben beschriebenen ENaC-defizienten Mäusen beobachtet wurden (3.3.1.1), schließen die Autoren eine Funktion der ENaCs in der Embryonalentwicklung aus, und vermuten statt dessen eine Rolle in der neuronalen Regeneration bei neurodegenerativen Erkrankungen.

 
3. Die DBA/2J Maus - ein Tiermodell für Glaukome:
 
Als ein möglicher Pathomechanismus für den apoptotischen Ganglienzelltod bei chronischen Glaukomen wird der bei Glaukompatienten oft diagnostizierte erhöhte Augeninnendruck diskutiert. Tiere der DBA/2J Mauslinie zeigen ab dem 6. Lebensmonat einen signifikant erhöhten Augeninnendruck mit nachfolgendem Ganglienzelltod, eine Reduktion in der Dicke der Retina, eine Atrophie und eine anomale Pigmentdispersion der Iris, und sind daher als Tiermodell für Glaukomerkrankungen beschrieben (John et al., 1998). Mehrere Veröffentlichungen beschrieben in den letzten Jahren diese Tiere im Hinblick auf Glaukomerkrankungen und Neurodegeneration. In einer neueren Studie von Moon et al. (2005) wurden im Detail die zellulären Veränderungen in der Retina erkrankter DBA/2J Mäuse untersucht. Die Autoren fanden ausschließlich Veränderungen in der inneren Retina, die durch eine Reduktion von Ganglien- und Amakrinzelltypen verursacht wurden; die Zellzahl anderer retinaler Neurone blieb unverändert. Ähnlich wie bei den DBA/2J Mäusen wird auch bei Glaukomerkrankungen des Menschen ein Verlust retinaler
Ganglienzellen in der inneren Retina detektiert. Zusätzlich deuten ERG-Studien an Glaukompatienten
auch auf Veränderungen in der äußeren Retina hin (Velten et al., 2001).
Ein Vergleich der DBA/2J Mauslinie mit anderen Mauslinien mit erhöhtem Augeninnendruck
und Retinadegeneration - DBA2NNia, AKXD-28/Ty oder B6/Col1a1r/r - zeigt, dass die DBA/2J Mauslinie
momentan das beste Tiermodell zur Untersuchung von chronischen Glaukomen darstellt. Der Stamm AKXD-28/Ty wäre zwar ein "saubereres" Druckmodell als der DBA/2J Stamm, da keine Irisveränderungen auftreten, aber es dauert fast 2 Jahre bis es zum Absterben retinaler Ganglienzellen kommt. Zusätzlich kommt es bei einigen Tieren immer wieder zu einer vollständigen Degeneration der Retina. Da die DBA/2J Mauslinie durch eine Vielzahl von Publikationen gut charakterisiert ist und auch in anderen Teilprojekten
als Modellsystem eingesetzt wird (Teilprojekt A3, Prof. C.-M. Becker; Teilprojekt A5, PD Dr. R. Enz; Teilprojekt B2.2, Prof. E. Lütjen-Drecoll), wollen wir uns im Rahmen dieses Teilprojektes ebenfalls auf die Untersuchung der DBA/2J Mauslinie konzentrieren.


Ziele:
Während die Funktion der ENaCs in der Niere oder der Lunge im Detail bekannt ist, weiß man
über ihre Aufgaben in der Retina nahezu nichts. Mit ein Grund sind sicherlich die widersprüchlichen
Ergebnisse zur Expression und Lokalisation der ENaC-Untereinheiten in der Retina. Das
Wissen um die präzise Lokalisation dieser Proteine in der Retina und in angrenzenden Epithelschichten
ist Voraussetzung für ein besseres Verständnis der Funktion der ENaCs sowohl in der
normalen als auch
der erkrankten Retina. Die einzelnen Zielsetzungen in unserem neu beantragten
Teilprojekt sind:

1. Die Klonierung der a-, b- und g-ENaC cDNAs aus der Mausretina gesunder und glaukomatöser
    Augen und die Analyse der Proteinsequenzen, um eventuell vorhandene Spleißvarianten zu
erkennen.
2. Die Herstellung und Charakterisierung (Isoform)-spezifischer Antikörper zum Nachweis der
    ENaCs in der Mausretina.
3. Die Untersuchung der zellulären Expression und der subzellulären Lokalisation der ENaCs in
    der Retina, dem retinalen Pigmentepithel und dem Ziliarkörper im Vergleich zwischen Augen
    mit normalem und erhöhtem Druck.
4. Untersuchung der entwicklungsabhängigen Expression der ENaCs in der Retina und dem retinalen
    Pigmentepithel im Vergleich zwischen Augen mit normalem und erhöhtem Druck.
5. Untersuchung eines möglichen Zusammenhangs zwischen der Genregulation von ENaCs und
    der Ganglienzell-Apoptose in der Retina der DBA/2J Maus.

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