[FAU-Logo] Sonderforschungsbereich 539

Zusammenfassung


Der bei chronischen Glaukomen auftretende Sehverlust wird durch apoptotisches Absterben retinaler
Ganglienzellen und Degeneration des optischen Nerven verursacht. Da beteiligte Mechanismen
weitgehend unbekannt sind, stellt die Identifizierung und Charakterisierung von molekularen
Faktoren der Pathogenese chronischer Glaukome einen zentralen Punkt der Forschung dar.

Neben dem oft vorhandenen erhöhten Augeninnendruck werden für chronische Glaukome weitere
pathogene Mechanismen beschrieben, wie z.B. die Wirkung neurotoxischer Substanzen und
der Einfluss von Nervenwachstumsfaktoren. Eine medizinische Behandlung schließt daher neben
der Reduzierung des Augeninnendruckes auch neuroprotektive Maßnahmen zum direkten Schutz
der betroffenen Ganglienzellen ein. Dafür ist allerdings ein umfassendes Wissen über molekulare
Prozesse des Ganglienzelltodes nötig. Ziel des Projektes ist daher die Identifizierung molekularer
Pathomechanismen des Absterbens retinaler Ganglienzellen.

An einer durch Glutamat vermittelten Zelltoxizität sind potentiell alle Mechanismen beteiligt, die
entweder die synaptische Glutamatkonzentration, oder die Sensitivität von Glutamatrezeptoren
erhöhen (z.B. Glutamattransporter, Kinasen, Phosphatasen). Während die Bedeutung ionotroper
Glutamatrezeptoren des NMDA-Typs für den apoptotischen Zelltod detailliert untersucht wurde,
war über eine Beteiligung metabotroper Glutamatrezeptoren nichts bekannt. Daher begannen wir
in den letzten Jahren mit der Untersuchung des molekularen Aufbaus des metabotropen Glutamatrezeptorsystems in der Netzhaut, sowie dessen Veränderung im Krankheitsverlauf chronischer
Glaukome. Wir identifizierten mehrere Proteine, die sowohl die synaptische Lokalisierung
als auch die Sensitivität metabotroper Glutamatrezeptoren steuern, und fanden eine Überexpression
dieser Proteine in der Retina eines Mausmodels für erhöhten Augeninnendruck.

Im Hinblick auf Glaukome ist die Überexpression des metabotropen Glutamatrezeptors Typ 6 (mGluR6)
äußerst interessant. Obwohl mGluR6 in der gesunden Retina ausschließlich in Bipolarzellen
exprimiert ist, wurde sein Transkript nach einer Schädigung des optischen Nerven auch
in Ganglienzellen detektiert, so dass ein Zusammenhang zwischen Ganglienzelltod und der Expression
von mGluR6 bestehen könnte. Da außer der Interaktion mit einem G-Protein keine Regulationsmechanismen
für mGluR6 bekannt sind, sollen in der nächsten Förderperiode Interaktionspartner von mGluR6
identifiziert werden. Es ist geplant, beteiligte Bindedomänen zu kartieren, die Expression
der Interaktionspartner in glaukomatösen Netzhäuten zu analysieren, und die physiologische
Bedeutung detektierter Proteininteraktionen zu untersuchen.

In einer parallel durchgeführten Screening-Studie identifizierten wir mehrere Gene, deren retinale
Expression bei erhöhtem Augeninnendruck erhöht war. Zwei dieser Genprodukte sind Mitglieder
der Familie spannungsgesteuerter Kaliumkanäle, deren Expression zwischen gesunden
und erkrankten Netzhäuten auf Proteinebene verglichen, und ihr Verhalten bei apoptotischer
Degeneration einer Ganglienzellinie untersucht werden soll.

Übersicht der angestrebten Ziele:

In der letzten Förderperiode fanden wir eine signifikante Überexpression des metabotropen Glutamatrezeptor
Typ 6 (mGluR6) und von zwei spannungsgesteuerten Kaliumkanälen (Kv6.1 und
Kv11.1) in der Netzhaut von Augen mit erhöhtem Innendruck in DBA/2J Mäusen (vgl. Abb. 3
und Abb. 4). Zudem wurde eine ektope Expression von mGluR6 in Ganglienzellen nach Verletzung
des optischen Nerven beschrieben (vgl. 3.3.1.2 c). Daher wollen wir in der nächsten Förderperiode
molekulare Regulationsmechanismen von mGluR6, Kv6.1 und Kv11.1 in der Netzhaut
von DBA/2J Mäusen und immortalisierten Ganglienzellen untersuchen. Im Einzelnen sind
die folgenden Schritte geplant:

mGluR6:
a) Identifizierung von mGluR6 Bindepartnern durch Affinitätschromatographie und massenspektroskopische
    Methoden (Maldi-TOF-MS)
b) Verifizierung der Proteininteraktionen durch alternative Techniken
c) Vergleich der subzellulären Lokalisierung von mGluR6 und identifizierten Bindepartnern in
    gesunden und erkrankten Netzhäuten von DBA/2J Mäusen
d) Kartierung interagierender Domänen der Bindepartner und Definition von Bindemotiven
e) Funktioneller Einfluss des mGluR6 Phosphorylierungsstatus auf die Proteininteraktionen
f)  Funktionelle Analyse der Proteininteraktionen in Zellsystemen
g) Einfluss der Proteininteraktionen auf die mGluR6 vermittelte Signaltransduktion in Neuronen
    der Netzhaut von DBA/2J Mäusen
h) Einfluss der Proteininteraktionen auf die Proteinsortierung

Kv6.1 und Kv11.1:
a) Vergleich der subzellulären Lokalisierung von Kv6.1 und Kv11.1 zwischen gesunden und
    erkrankten Netzhäuten von DBA/2J Mäusen
b) Analyse der Genexpression von Kv6.1 und Kv11.1 in einer immortalisierten Ganglienzellinie
   unter apoptotischen Bedingungen
c) Untersuchung der Proteinsortierung der Ionenkanäle in apoptotischen Ganglienzellen
d) Vergleich der Kaliumleitfähigkeit gesunder und apoptotischer Ganglienzellen durch elektrophysiologische
   ”patch-clamp”-Ableitungen.


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