[FAU-Logo] Sonderforschungsbereich 539

Zusammenfassung


Ausgangspunkt dieses Teilprojektes war die Hypothese des exzitotoxischen Zelltodes bei Glaukom,
nach der die ungeregelte Freisetzung des exzitatorischen Transmitters Glutamat zum Ganglienzellverlust
führt. Durch sekundäre Aktivierung von NMDA-Rezeptoren soll ein massiver Ca2+-Einstrom ins Zytosol
bewirkt werden, der über die Bildung von reaktiven Sauerstofformen (ROS) zur neuronalen Apoptose führt.
Dementsprechend sollte die Vulnerabilität retinaler Ganglienzellen mit einer selektiven Expression
von NMDA-Rezeptorvarianten korrelieren. Tatsächlich ließen sich eine ontogenetische Regulation
von NMDA-Rezeptoren und in humaner Retina auch eine signifikante Expression bis ins hohe Alter nachweisen. In Strukturuntersuchungen konnten wir eine molekulare Komplexbildung der Rezeptorvariante NR2B mit dem Ryanodinrezeptor RyR2, einem intrazellulären Ca2+-Kanal, charakterisieren, die jedoch nicht in der Retina nachweisbar ist. Obwohl die Zielmoleküle der exzitotoxischen Zellnoxe somit in der Retina
vorkommen, zeigten kultivierte Retinaneurone nur eine geringe Glutamatsensitivität. Wir griffen daher
auf das Apoptosemodell des Schlangengifts b-Bungarotoxin zurück: Dieses Toxin greift ‘stromabwärts‘
vom NMDA-Rezeptor in die Signalkette der Apoptose ein und ermöglicht es, selbst frühe Phasen der Zellnoxe
zeitlich aufzulösen. Nach Toxinbindung kommt es zur Freisetzung von Phospholipiden und zum Anstieg des intrazellulären Calciums, dem Ceramide und ROS folgen. Wahrscheinlich ausgelöst durch den oxidativen Stress wird die Lipidzusammensetzung der Zellmembran massiv verändert. Eben diese Veränderungen von Membranlipiden, insbesondere die Bildung von Hydroperoxiden, fanden wir auch beim hereditären Glaukom
der Mauslinie DBA/2J. Einerseits sind damit Analogien von toxischem und glaukomatösem Zelltod
sichtbar geworden, andererseits ist ungeklärt, ob diese Noxen sich nur in ihrer Kinetik oder auch
in grundlegenden Mechanismen unterscheiden. Daher sollen die im b-Bungarotoxin-Modell und
beim murinen Glaukom auftretenden Strukturveränderungen von Lipiden, Proteinen und DNA
vergleichend charakterisiert und die von der Plasmamembran ausgehenden Schadenskaskaden
identifiziert werden. Diese Fragestellungen zur oxidativen Zellschädigung sollen in der kommenden
Förderperiode überwiegend mit massenspektrometrischen Verfahren bearbeitet werden
.

Ziele
Dieses Teilprojekt geht von der Arbeitshypothese aus, daß die Schadenskaskade des chronischen
Ganglienzelluntergangs bei Glaukomen in pathologische Redoxvorgänge mündet, die zu Struktur-
und Funktionsveränderungen von Lipiden, Proteinen und DNA führen. Am Zellkulturmodell
der durch das Schlangengift b-Bungarotoxin induzierten Apoptose und beim hereditären Glaukom
der Mauslinie DBA/2J sollen die zum Zelltod führenden Schadenskaskaden vergleichend
untersucht werden. Einerseits sind in den Vorarbeiten weitreichende Analogien von toxischem
und glaukomatösem Zelltod sichtbar geworden, andererseits bleibt die Frage unbeantwortet, ob
die Noxen und Mechanismen der Zellschädigung sich nur in ihrer Kinetik oder auch in grundlegenden
Abläufen unterscheiden. Auf diese Alternativhypothesen bauen die Fragestellungen zur Zellschädigung in der Retina auf, die in der kommenden Förderperiode überwiegend mit massenspektrometrischen
Verfahren bearbeitet werden sollen:

1. Lipidoxidation und protektive Systeme. Im b-Bungarotoxin-Modell des neuronalen Zelltodes
    werden die Lipide der geschädigten Zellen massiv oxidiert. Die Lipidmarker der oxidativen
    Zellschädigung sollen massenspektrometrisch charakterisiert und mit den verschiedenen Stadien
    der Zellnoxe korreliert werden. Am Mausmodell des Sekundärglaukoms soll parallel dazu nach
    Lipidveränderungen gesucht werden, die den Stadien der b-Bungarotoxin-Noxe (Shakhman et
    al., 2003) entsprechen. Zugleich soll nach Beeinträchtigungen der protektiven Mechanismen des
    Auges (z.B. Ascorbinsäure, Glutathion) gesucht werden, die das Auftreten oxidativer Zellschäden
    begünstigen.

2. Fusogenität und Motilität von Proteinen in oxidativ geschädigten Membranen. Nach den
    Vorstellungen der für akute Zellschäden entwickelten Exzitotoxizitätshypothese beeinflußt der
    physiologische Aktivierungsgrad eines Neurons dessen Vulnerabilität. Mögliche präsynaptischen
    Auswirkungen der Lipidoxidation auf die Neurosekretion sollen in einem Fusionsmodell für synaptische
    Vesikel getestet werden. Auf der postsynaptischen Seite soll für den exzitatorischen
    NMDA-Rezeptor und einen seiner Gegenspieler, den inhibitorischen Glycinrezeptor, untersucht
    werden, ob und ggf. wie die Oxidation von Phospholipiden die Oberflächenverteilung und Rezeptormotilität
    und damit die neuronale Chemosensitivität beeinflußt.

3. Proteinoxidation: Veränderungen zellulärer Signalwege. Oxidativer Zellstreß führt zu
    posttranslationalen Modifikationen von Proteinen, die insbesondere bei Proteinen der zellulären
    Signaltransduktion nachhaltig in deren Funktion eingreifen. Zu oxidativen Strukturänderungen
    zählen die Nitrosylierung von Sulfhydryl- und Tyrosylgruppen, die wiederum durch Methoden
    der Proteomik umfassend detektierbar sind.

4. DNA-Oxidation und apoptotischer Zelltod. Die Bildung von reaktiven Sauerstofformen bei
    oxidativem Zellstreß macht auch vor der DNA der Zelle nicht Halt: Durch den Angriff von reaktiven
    Sauerstoffarten auf DNA entsteht 8-Oxoguanin, das bei Replikation wiederum fehlerhafte
    Basenpaarungen (8-Oxoguanin => A) mit der darauf folgenden Transversionen G => T nach sich
    zieht. Von diesen oxidativen Veränderungen sind sowohl das somatische als auch das mitochondriale
    Genom betroffen. Da diese bei natürlichen Alterungsprozessen beschriebenen Vorgänge
    bei oxidativem Zellstreß ebenfalls massiv beschleunigt sind, ist ihr Vorkommen auch bei
    Glaukom zu erwarten. Im Gegensatz zur Proteinoxidation, die infolge der Umsatzraten von Proteinen
    bei akuten Zellschäden im Vordergrund stehen dürfte, sollten DNA-Noxen bei lang anhaltenden
    Zellschäden akkumulieren und daher als Vermittler des chronischen Zelltodes in Betracht
    kommen.